IV. RESULTATS
Il existe une forte homologie entre les séquences des glycoprotéines transmembranaires des différents isolats du VIH-1 et les séquences des glycoprotéines transmembranaires des virus de limmunodéficience simienne (VIS) et des VIH type 2. Il nexiste aucune homologie de séquence avec une protéine de structure connue.
L'alignement des 29 séquences de VIH-1 montre une forte conservation des séquences entre les différents isolats (Annexe 1). Ainsi, pour le peptide N51, 44/51 positions sont identiques ou similaires entre les différentes séquences (Annexe 2). Toutes les positions d sont conservées et seules deux positions a (L34 et I69) présentent une variation. Ainsi, dans 3/29 séquences le résidu L34 est remplacé par un résidu méthionine et dans 16/29 séquences le résidu I69 est remplacé par un résidu valine. Néanmoins, ces mutations sont conservatives, les résidus étant similaires. Ceci montre l'importance de ces résidus qui donnent, par leur interaction, la stabilité au trimère "coiled coil" central. Parmi, les positions e et g, seule une position g est mutée (L55: 25/29 L et 4/29 M). Les variations les plus grandes concernent les positions b, c et f qui sont plus exposées quand on regarde la projection en "helical wheel". Pour C43, la proportion de résidus identiques ou similaires est de 29/43. Les positions a et d sont conservées quelle que soit la distribution choisie. Il ny a pas de "gap" dans lalignement au niveau de ces peptides.
3. Recherche de sites fonctionnels
Aucun motif fonctionnel significatif n'est détecté sur la séquence de lisolat BRU. Sur les cinq sites potentiels de glycosylation, seuls trois sont conservés: N100, N105 et N126.
4. Prédiction de structure secondaire
Les résidus des peptides N51 (48/51) et C43 (29/43) sont prédits en hélice, ce qui est en accord avec les observations expérimentales. La séquence de 35 résidus séparant ces deux peptides est prédite en structure apériodique sauf au niveau des deux résidus cystéine. Dans cette région, un feuillet b antiparallèle est prédit. La recherche dhomologie sur SCOP et la recherche de motif sur la PDB confirme cette prédiction (Annexe 3). Dans le premier cas, plusieurs séquences, avec une homologie de séquences dans cette région, présentent des structures secondaires en feuillet. En particulier, deux capsides de poliovirus (code PDB: 1pvc et 1pov) adoptent un repliement en feuillet b antiparallèle. Pour la seconde étude, les motifs CX5C, les résidus cystéine formant un pont disulfure, sont présents dans des régions repliées en feuillet. Des coudes b sont aussi observés très fréquemment. Un coude b est prédit dans cette région par certaines méthodes (Levin, SOPMA et DPM). Les données de RMN trouvées dans la littérature indiquent la présence dun coude b de type 1 inverse pour les résidus SGKL.
Les résidus des heptades caractéristiques des structures "coiled coils" sont hydrophobes aux positions a et d et polaires pour les autres positions. Pour les positions e et g, on trouve parfois des résidus chargés qui forment des ponts salins interhélices. Les deux séquences, N51 et C43, ne sont pas prédites comme séquences donnant des motifs structuraux de type "coiled coils" par les algorithmes de Lupas et Berger (Annexe 4). Pour le premier algorithme, un signal non significatif est observé pour les deux séquences. Le second algorithme donne un signal très faible pour la seconde séquence uniquement. Les résultats du calcul de lhydrophobie moyenne par position sont présentés figure 7. Pour le peptide N51, les résidus des positions a et d sont majoritairement hydrophobes ou dune nature tolérée à ces positions (Q ou T). De tels résidus polaires établissent des interactions polaires enfouies très stables. Les résidus des positions e et g, sont majoritairement hydrophobes ou polaires neutres. Seuls trois résidus sont chargés à ces positions: un résidu à lextrémité N-terminale (R31) de N51 et deux à lextrémité C-terminale (R68 et E73). En comparaison avec l'hémagglutinine ou la protéine p15E (Annexe 5), la présence de résidus hydrophobes ou polaires neutres est une caractéristique spécifique de la glycoprotéine gp41. Les résidus des positions a et d du peptide C43 sont globalement hydrophobes ou d'une nature tolérée (N, Q, T et W) à ces positions dans les séquences. Dans la distribution proposée par Lu et al. (1995) une position d est occupée par le résidu glutamate E148. Dans celle proposée par Weissenhorn et al. (1997a), il n'y a pas de résidu chargé dans les positions a et d. Cependant à l'extrémité N-terminale du peptide, il y a deux positions a successives et un résidu supplémentaire entre la seconde position a et la première position d. La présence du site de glycosylation conservé N120 dans la séquence de C43, ainsi que la distribution des résidus hydrophobes, confirment la position centrale des chaînes N51 et la position externe des chaînes C43.
B. Génération des modèles tridimensionnels
Pour générer les modèlesctridimensionnels, nous nous sommes inspirés du modèle proposé par Lu et al., en 1995. Les moyennes des distances et des angles dihèdres mesurées sur le mutant pII de GCN4, qui ont servi de contraintes pour générer les modèles tridimensionnels, sont indiquées table 1.
Les monomères N51 générés ont permis de déterminer le nombre de contraintes intrachaînes nécessaires pour obtenir des hélices régulières et voir que ces hélices peuvent adopter une certaine courbure. En générant un trimère (N51)3 avec les contraintes interchaînes indiquées table 1, nous avons pu reproduire le surrenroulement observé dans les structures "coiled coils". Le rmsd moyen sur les 10 structures générées est de 7,0 Å. Le rmsd est calculé sur les Ca. Seule la structure 8 présente une énergie négative de -463,792 kcal/mol. Pour cette structure, 13 contraintes de distances et 4 contraintes dangles sont violées. Pour le trimère d'hétérodimères, le rmsd moyen sur les 10 structures est de 1,33 Å. Parmi ces structures, quatre présentent une énergie négative voisine comprise entre -2374,95 et -2407,26 kcal/mol. Le rmsd moyen sur les Ca de ces quatre structures est de 0,99 Å. Toutes ces structures présentent une violation de contraintes d'angles dièdres. Une structure présente deux violations de contraintes de distances en plus. L'enfouissement des positions a et d dans le sillon formé entre deux chaînes N51 est le troisième critère utilisé pour sélectionner les structures. Seule une structure parmi les quatre répond à ce critère. Cette structure a été vérifiée avec PROCHECK. D'après le diagramme de Ramachandran, tous les angles j et y des 264 résidus qui ne sont ni à une extré mité, ni une glycine, sont dans la région la plus favorable pour les hélices a (Annexe 6), Le diagramme c1- c2 montre une dispersion des angles c1 et c2 plus grande par rapport aux positions favorables. Cependant, aucun ne présente une conformation défavorable. Le rmsd moyen entre les Ca des résidus 5-30 du trimère pII de GCN4, déplacés d'heptade en heptade le long du trimère central (N51)3, et un nombre équivalent de Ca sur la structure est de 0,70 Å. La meilleure superposition est présentée figure 8.
Sur la figure 9a, on peut voir que les chaînes externes C43 se placent dans les sillons hydrophobes formés entre deux chaînes centrales N51. La figure 9b, présente les interactions entre les positions e et g de N51 et les positions a et d de C43.
En regardant la nature des résidus des positions e et g de N51 et celle des résidus des positions a et d de C43, nous avons positionné verticalement les chaînes N51 et C43 avec les contraintes de distances interchaînes N51-C43 de la table1 appliquées aux résidus indiqués table 2. Pour vérifier la validité du positionnement des chaînes, nous avons comparé les distances mesurées par RPE et celles mesurées sur le modèle (table 3). Seule la distance entre les résidus W60 et T116 sécarte nettement de la valeur attendue.
En mesurant les distances entre l'extrémité C-terminale de N51 et l'extrémité N-terminale de C43, nous avons pu constater que les chaînes C43 prolongeant les chaînes N51 sont celles situées dans le sens inverse des aiguilles d'une montre quand on regarde le complexe selon laxe de symétrie depuis le peptide de fusion (Figure 10).
La séquence 64-79, de lextrémité C-terminale de N51, émerge du trimère dhétérodimères pour former un trimère (Figure 11). Cette séquence semble donc accessible. Il est intéressant de noter que cest au niveau de cette séquence que lon retrouve des résidus chargés aux positions e et g (R68 et E73) alors que ces positions sont occupées par des résidus hydrophobes ou polaires neutres dans la zone dinteraction avec C43. La seule exception étant le résidu R31 qui est neutralisé dans notre modèle avec le résidu E148.
Enfin, on peut constater que dans notre modèle, les peptides DP107 et DP178 (sans les sept résidus C-terminaux) se chevauchent comme attendu (Figure 12).
La taille de ce complexe est d'environ 85 Å de long et de 28 Å de diamètre.
